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荧光显微镜原理和应用

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荧光显微镜的原理和结构特点:荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源,经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下,即使荧光很微弱也易辨认,敏感性高,主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 

 
荧光显微镜的基本构造是由 普通光学显微镜加上一些附件的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W),它可发出各种波长的光,但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长 ,所以需加用激发滤片,仅使一定波长的激发光透过 照射到标本上,而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后,在极短时间内发射出较照射波长更长的 可见荧光。
 
荧光具有专一性,一般都比激发光弱,为能观察到专一的 荧光,在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二:一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛,二是选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。   
 
荧光显微镜就其光路来分有两种:
透射式荧光显微镜: 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用 暗视野集光器,也可用普通集光器,调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观察较大的标本材料较好。 
 
落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜,与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面,即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器,它与光铀呈45。角,激发光被反射到物镜中,并聚集在样品上,样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜,反回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块,可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强。  
 
荧光显微镜使用方法.  
打开灯源,超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。     
 
透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片,在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的插块。     
 
用低倍镜观察,根据不同型号荧光显微镜的调节装置,调整光源中心,使其位于整个照明光斑的中央。    
 
放置标本片,调焦后即可观察。 使用中应注意:末装滤光片不要用眼直接观察,以免引起眼的损伤;用油镜观察标本时,必须用无荧光的特殊油镜;高压汞灯关闭后不能立即重新打开,需经5分钟后才能再启动,否则会不稳定,影响汞灯寿命。  
 
观察  
在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片,可见经o.01%的丫啶橙荧光染料染色的细胞,细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)

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