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故障诊断奥林巴斯显微镜配置和其他常见错误

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像任何形式的摄影一样,显微摄影可以容易地出现各种故障和错误,无论显微镜设备的复杂程度如何,或是显微相机的经验水平和技能。错误必须仔细检查以确定来源,这通常是由于设备故障,样品准备不良,技术不当或处理错误导致的。

 

大多数显微照相误差可以追溯到显微镜的光学配置,包括不正确调整的照明,错误的过滤器的使用,或聚光镜和/或场孔光阑的错误设置。下一个最常见的问题是由于标本制备不良和样品或显微镜光学元件上的污垢,灰尘或污染油引起。图1显示了小麦锈病脓疱(由真菌小菜蛾感染引起的)的显微照片,其显示了几种常见的显微照相差错。该图的中心部分(包围在一个白色的圆圈中)不对焦,左上角和右上角显示来自场隔膜和渐晕的阴影。使用黑色的显微照片中的对比度误差 白色膜在图1的左下部分中表示为在显微照片中导致太多图像对比度的对比度滤光片选择不佳的区域。在图1的右侧的白色圆圈中示出了焦点问题,并且由于物镜前透镜上的振动,球面像差和污染油引起的样本细节和对比度的缺乏。还包括在显微照片中的是膜损伤误差粉尘污染。这些和其他类似的错误,例如使用过于严重染色或过厚的标本,代表了在常规显微照相术下面临的最常见的显微镜错误。以下段落涉及显微照相中的具体错误和故障,并提出建议的补救措施。球面像差和物镜前透镜上的污染油在图1右侧的白色圆圈中示出。显微照片中还包括膜损坏误差和灰尘污染。这些和其他类似的错误,例如使用过于严重染色或过厚的标本,代表了在常规显微照相术下面临的最常见的显微镜错误。以下段落涉及显微照相中的具体错误和故障,并提出建议的补救措施。球面像差和物镜前透镜上的污染油在图1右侧的白色圆圈中示出。显微照片中还包括膜损坏误差和灰尘污染。这些和其他类似的错误,例如使用过于严重染色或过厚的标本,代表了在常规显微照相术下面临的最常见的显微镜错误。以下段落涉及显微照相中的具体错误和故障,并提出建议的补救措施。例如使用过度染色或过厚的标本,代表了在常规显微照相术下面对显微镜的最常见的错误。以下段落涉及显微照相中的具体错误和故障,并提出建议的补救措施。例如使用过度染色或过厚的标本,代表了在常规显微照相术下面对显微镜的最常见的错误。以下段落涉及显微照相中的具体错误和故障,并提出建议的补救措施。

图片失焦,模糊或锐化的 - 缺乏适当的焦点和/或模糊图像代表了显微照相中最常见的错误之一。这些误差的来源通常是显微镜支架的振动或光学元件与薄膜平面之间焦距的不正确调整。通常,图像将通过目镜以尖锐的焦点出现,但所得的显微照片模糊或不清晰(图2(a))。这表明胶片平面和观察光学元件可能不是parfocal。在装有聚焦望远镜的显微镜中,检查标线上的十字线以确保它们处于尖锐的焦点。仔细调整目镜掩模版(如果配备好)与聚焦望远镜之间的对焦,以使两个光罩同时对焦。如果目镜显示对焦的样品,但是目镜中的标线没有聚焦,则样品图像将在胶片上看起来不清晰,反之亦然。

焦距偏差通常以低功率(1倍-4倍)的物镜出现,其中胶片平面的焦点深度非常浅,并且显微镜对焦旋钮的微小误差导致不清晰的图像(见图2(a))。目镜和聚焦望远镜中的光罩应该是尖锐的焦点,并且眼睛之间的瞳孔之间的距离应该被适当地保持。使用低倍率物镜(10x),使用具有尖锐边缘定义的台式千分尺或样品,仔细地将样品对准目镜。接下来,调整聚焦望远镜中的掩模版,直到图像处于锐焦状态,确保当叠加在空中图像上时,该掩模版中的薄十字线也被聚焦和不同。许多制造商提供售后市集重点援助,这是一个简单的可调节放大镜,可用于查看聚焦望远镜分划板以辅助对焦调整。调整两个目镜,使它们彼此对焦和聚焦望远镜。还要检查投影镜头或光电管目镜,确保其牢固就位。

当将标准的单反相机用于显微照相时,图像必须通过相机对焦取景器(通常是玻璃幕)进行聚焦。在低放大率下,屏幕不存在问题,但是如果研磨玻璃的表面太粗糙,则在较高放大倍率下聚焦变得困难。如果出现此问题,请切换到具有清晰中心的聚焦屏幕,用于图像的关键焦点,或者通过将小盖玻片固定在玻璃屏幕表面上来修改大幅面相机的聚焦屏幕(如John Delly在其书中所提到的那样)“ 通过显微镜摄影 ”)使用加拿大香脂作为粘合剂。所产生的组合在屏幕覆盖的屏幕区域中提供透明中心。Delly还建议在固定在盖玻片上之前,使用软铅笔或印度墨水在玻璃表面上绘制十字或两个对角线。该程序为视差聚焦提供了一套“十字线”。

 

在图2中示出了几个显微镜照片,其显示了显微镜焦点的错误(图2(a))和由于振动引起的钝化图像(图2(c))。标本是一种薄薄的Tilia(椴木)茎,用专门为植物组织设计的四重混合物染色。图2(a)描绘了由于由上述误差引起的光学器件和膜平面之间的焦距的不正确调整而不对焦的典型显微照相。右图(图2(c))是相同视场的显微照片,但受到严重振动的影响,导致图像锐度的损失。图2(b)中的显微照片说明了尖锐焦点的Tilia染色薄片。

散光和必须戴眼镜的显微镜学家即使通过目镜出现焦点,也可能难以产生清晰的图像。佩戴眼镜时通过聚焦望远镜调整样本焦点往往特别困难。治疗方法是使用一组高眼点目镜或聚焦望远镜来纠正问题。请与显微镜制造商联系确定这些附件是否可用。

当样品制备太厚或显微镜载玻片无意中被颠倒检查时,聚焦也可能是一个问题(图3(a))。通常可以通过使用长工作距离物镜来克服厚度误差,但最佳的解决方案是使用较薄的部分重新制作样品,或者在制剂上更紧密地挤压盖玻片。倒置显微镜载玻片的简单固定装置是将其翻转,因此盖玻璃面对物镜(图3(a)和3(b))。偶尔,在样品制备期间,几个盖玻片将粘在一起,并且所得的显微镜载片将具有两个或更多个盖玻片,导致所得显微照片中的球面像差问题。如果怀疑这个错误,仔细检查包含盖玻片的显微镜载玻片是否存在干涉条纹,这将由于两个盖玻片之间的残留空间而发生。使用一对镊子强制最上面的盖玻片。

在高放大倍数干物镜上校正套环的不正确调整或使用具有高数值孔径的高干燥物镜与错配的盖玻片(盖玻片)通常是不清晰的显微照片的原因(图3(c))。当显微镜盖玻片太厚或太薄时,这些误差是由球面像差的欠矫或过矫矫引起的。在这种情况下,不可能精确地对准显微镜并获得清晰的图像。盖玻片厚度问题的解决方案是用一个正确的厚度(通常是1½盖玻璃,其平均值为0.17毫米厚,标准变化在0.16和0.19毫米之间)替换不合适的盖玻片,或者使用配备校正领可以调整以匹配盖玻片的厚度。如果盖玻片厚度不能调整(即粘贴在标本滑块上),或者如果厚度未知,并且没有使用矫正套环的物镜,则有时可以通过使用可比较的油浸物镜来解决问题放大。因为浸油的折射率与盖玻片的折射率非常相似,所以厚度变化不那么重要。

 

图3所示的显微照片显示球面像差误差的影响。标本是感染有枯萎病菌的马铃薯(Solanum tuberosum)组织的染色薄片。图3(a)示出了反转(倒置)显微镜载玻片的效果,其导致由于球面像差导致的图像中的对比度和清晰度的损失。同样,图3(c)示出了在高数值孔径和高放大率物镜上校正套环的不正确调整。该样品的盖玻片厚度为0.17毫米,但校正套环的厚度为0.23毫米。图3(b)显示了当盖玻片厚度优化并且显微镜被适当调整时,显微照片应该如何出现。

不清晰图像的另一个原因是物镜前透镜,照片目镜(投影透镜)的顶部镜头或标本滑块上的油(来自指纹的浸油或天然油)。存在于干燥物镜的前透镜上的油是当将物镜放置在预先润滑的载玻片上的位置时可能发生的常见事故。如果立体显微镜可用,请取下物镜和/或照片目镜,并以高倍率仔细检查。使用这种技术,在前镜上经常会看到油污。从显微镜镜头去除油可能是困难的,并且经常导致用新的灰尘和碎屑代替存在于镜片上的旧灰尘。首先用镜片组织轻轻地从表面清除多余的油分,清理镜片,然后使用手术棉或高品质镜片纸的木制涂抹器,在用三氯乙烷,乙醚或二甲苯浓缩后将其清洁。避免使用过多的溶剂,这可以攻击用于将镜头固定到其底座上的水泥。

除去污染的油后,使用骆驼毛或貂毛刷清除镜头上可能存在的灰尘,污垢或碎屑。可以通过将刷子浸入少量的乙醚并将其摇晃干燥来脱脂。气球或橡胶耳塞注射器通常可用于吹脱透镜上的松散灰尘,但不要使用罐装空气,因为它可能会留下比浸油更难除去的残留物。污染浸渍油最常发生在设计用于浸渍介质的物镜上,但是当使用浸没物镜观察残留油的盖玻片的顶部摆动时,干燥物体也可能被污染。当遇到焦点错误或者具有这些物镜的不清晰图像时,请始终检查干燥物镜的前置镜头是否有污染。

在许多较老的显微镜中,物镜与目镜特别匹配,以便校正最终图像中的光学像差。不清楚的图像也可能由显微镜主体管和物镜之间的管长度机械尺寸不匹配引起。用于固定管长度显微镜的大多数物镜是设计为管长为160毫米,但这并不是不变的,并且使用管长不匹配的物镜会导致球面像差的引入,从而降低图像清晰度。管子长度要求通常刻在物镜筒上,因此检查该值以确保在使用前与显微镜兼容。具有无穷远光学校正的物镜旨在用于配备有管透镜的显微镜,并且不适合用于较老的标准固定管长度显微镜。同样,为固定管长度显微镜设计的物镜不应与无穷远校正显微镜一起使用。


【上一个】 奥林巴斯显微镜激光共聚焦的应用 【下一个】 徕卡显微镜相差的原理

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