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徕卡显微镜相差的原理

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相差对比是一种光学对比技术,用于在光学显微镜下可见的未染色相位物体(例如扁平细胞)。使用相差显微镜,可以在高对比度和丰富的细节中观察明亮度不显眼和透明的细胞。


使用相移图像形成

相位物体会导致通过样本的光的相移。因为只有幅度偏移(强度的差异)对于人眼或光电检测器是可见的,所以样本的染色将介导振幅偏移和通过的光的强度差。然而,许多染色试剂对活细胞是有毒的。相差显微镜提供了使用由光程长度差异引起的相移,使样本在光学显微镜下可见的可能性。它通过产生的光波的干扰将相移改变为幅度偏移。

相差显微镜的技术是在20世纪30年代由荷兰物理学家Frits Zernike开发的。该技术在1942年投入使用后,Zernike于1953年被授予诺贝尔物理学奖。


使用相移图像形成

相位物体会导致通过样本的光的相移。因为只有幅度偏移(强度的差异)对于人眼或光电检测器是可见的,所以样本的染色将介导振幅偏移和通过的光的强度差。然而,许多染色试剂对活细胞是有毒的。相差显微镜提供了使用由光程长度差异引起的相移,使样本在光学显微镜下可见的可能性。它通过产生的光波的干扰将相移改变为幅度偏移。

相位显微镜的技术是在20世纪30年代由荷兰物理学家Frits Zernike开发的。该技术在1942年投入使用后,Zernike于1953年被授予诺贝尔物理学奖。

图1a:MDCK细胞,相差显微镜              图1b:MDCK细胞,明场显微镜


 

图1c:变形虫变形菌,相差显微镜           图1d:变形虫变形杆菌,明场显微镜


光波的干扰

光路长度是光路中两点之间的折射率和厚度的乘积。它与运输时间和光速有关。光路长度的差异导致光波穿过样本时的不同速度(即相移)。结果发生相位差异。与周围介质相比,较高的折射率导致光波的减速和相位的延迟。

干扰描述了两个波彼此的相互作用以及根据叠加原理形成的新波形。光波干涉的相关参数为光波幅值。如果两个波浪干扰,则所得到的光波的幅度将等于两个干扰波幅度的矢量和。

如果所得到的波的幅度增加,则干扰将被描述为具有建设性的。如果两个波峰或两个波谷在同一时间点相遇,则将是这种情况。另一波的波峰和另一波的波峰也可能在同一时间点相遇。这导致所得到的波的幅度减小。这两个波浪之间的干扰称为破坏性的。


相位差显微镜中的光路

相差显微镜的关键要素是环形孔和相位板。环形孔被放置在聚光镜的前焦平面上,并限制穿透光波的角度。相位板位于物镜的后焦平面上,并具有由通过它的光调光并使其相位改变λ/ 4的材料制成的相环。λ表示光的波长。

在相位显微镜下,在Köhler照明条件下,不与样品相互作用的光波作为物镜的后焦平面上的亮环聚焦。光环在光轴上与相位环空间匹配,导致未透光的相移。被样品衍射的光不会主要撞击相环,因此不受影响。

在受影响和未受影响的光波之间,总相移高达λ/ 2。未衰变光的相位在相位上提前λ/ 4,衍射光波通常被生物样本延迟λ/ 4。λ/ 2的总相移允许光波在图像平面中的破坏性干扰。为了减弱通过相环的未透光,重要的是避免与偏斜光相比未发光的外显。

如相位显微镜观察到的,λ/ 2的相移产生最大的相消干涉效应,因为波峰和槽在同一时间点有效地达到。因此,光波的幅度减小,相位对象的相移被变换为振幅。


图2:相差显微镜中的光路。通过聚光镜环的环形光通过聚光镜聚焦在样品上。环形光的一部分由样品(例如质膜,细胞器等)的光密度结构衍射,经历大约1/4λ的相移(通常用于生物样本)。该相移并且衍射光绕过相环,并且几乎不受相环(主要位于物镜的后焦平面)的影响。相比之下,来自聚光镜环的直接环形光将撞击相环,这将使直射光变暗,并引起相移(通常前进为1/4或延迟¾λ为正相位对比)。由于由样品折射的光与通过相位的光之间的总相移将达到1/2λ,将会发生相消干涉。光密度结构将因此显得较暗(呈正相位对比)。
相差显微镜中的光路



相差环

图3:相差环是相差显微镜的中心部件。通常由灰色过滤器和保持板组成。通过试样而不经历衍射的光部分通过相环(左箭头)。灰色滤光片使光线变暗以避免辐射。保持板延迟非衍射光的相位,以允许通过使样本(右箭头)经历相移和衍射的光波干涉。































正负两种形式的相位对比

相位对比有两种形式:正负相位对比度。它们主要不同于用于照明的相位板。在正相位对比中,通过相位的光的相位与偏离光相比是前进的,而在相位相位上则呈相位延迟。负相位对比度的相位延迟导致相位差的破坏。光波同相,而不是破坏性干扰,会产生相当大的干扰。这导致所得到的光波的幅度增加。  

在正相位显微镜中,具有比周围介质更高的折射率的物体显示为比具有较低折射率的物体更暗。对于负相位对比度则相反。


解释相位图像

相差显微镜显示样本的光程长度差异。光路长度与样品的厚度和折射率有关。细胞结构如质膜和细胞器对光程长度有深远的影响。许多细胞(特别是在细胞培养物中)具有平坦和规则的形状,它们在明场显微术中几乎看不到。

这种细胞的相差图像放大细胞结构的差异,并且可以被认为是光密度图,因为光密度对样品或材料的折射率有很大的影响。然而,由于不直接依赖于光路长度的差异,因此几种效应会使相位对比图像的正确解释复杂化。

光环效应描述了正相位对比度的明亮边缘的外观或大对象周围的负相位差的暗边缘。由于来自试样的一些衍射光也穿过相位环,所以形成光晕。由未形成的波形成的光环比相位稍微小一点,并且来自试样的低空间频率衍射光波可以通过环带。通过相位的偏斜光保持90°的相位差,因此不受破坏性干扰的影响。这导致对比度的逆转,并导致大对象边界处的光环。

遮光效果描述了以与周围介质相同的光强度显示样品的均匀部分的情况。尽管通过这些区域的光经历相移,但仅发生少量衍射,并且散射角大大降低。因此,这些光波如未亮化的光进入相环,不会受到干扰。

相差显微镜中的另一个问题可以是对比反演。如果折射率较低的物体与折射率较低的物体相邻,则它们将显得更亮,而不是较暗(对于正相位差)。在这样的区域中,相移不是生物样本的λ/ 4的通常偏移,而不是破坏性干扰,发生建设性干扰(与负相位相反)。

虽然这些效应可以使相位对比图像的解释变得困难,但相位显微镜是成像相位物体的一种方便和重要的光学对比度技术。此外,相差显微镜可以调查活体标本中的细胞功能和结构,使其成为生物研究中最常用的对比方法。

  

图4a:曲霉菌,相差显微镜         图4b:大鼠睾丸,相差显微镜      图4c:菜豆,相差显微镜


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