使用尼康 TS2 显微镜观察动物细胞细胞器分布,一般有以下步骤:
尼康 TS2 显微镜样品制备
细胞培养:选取合适的动物细胞系,如 HeLa 细胞,在含有适宜营养成分的培养基中,于培养箱内培养,使细胞处于良好的生长状态。
细胞固定:当细胞生长至对数生长期时,用胰蛋白酶将细胞从培养瓶壁消化下来,制成细胞悬液。然后将细胞悬液滴加在载玻片上,待细胞贴附后,使用 4% 多聚甲醛溶液对细胞进行固定,一般固定 15 - 30 分钟,以保持细胞的形态和细胞器的结构。
细胞通透:用含有 0.1% Triton X - 100 的 PBS 溶液处理细胞,作用 5 - 10 分钟,使细胞膜具有通透性,便于抗体等试剂进入细胞与细胞器结合。
封闭:将载玻片放入含有 5% 牛血清白蛋白(BSA)的 PBS 溶液中,室温封闭 30 分钟,以减少非特异性结合。
尼康 TS2 显微镜抗体孵育:
加入针对特定细胞器的一抗,如抗线粒体的抗体、抗内质网的抗体等,4℃孵育过夜。一抗能够特异性地结合到相应的细胞器上。
用 PBS 溶液洗涤载玻片 3 次,每次 5 分钟,以去除未结合的一抗。
加入与一抗对应的荧光标记二抗,室温孵育 1 - 2 小时。二抗可以与一抗结合,从而使细胞器被荧光标记,便于在显微镜下观察。
再次用 PBS 溶液洗涤载玻片 3 次,每次 5 分钟,去除未结合的二抗。
细胞核染色:用含有 DAPI(4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚)的染液对细胞进行染色,DAPI 可以特异性地结合到细胞核的 DNA 上,使其发出蓝色荧光,从而标记出细胞核的位置。染色时间一般为 5 - 10 分钟,然后用 PBS 溶液洗涤 1 - 2 次。
封片:在载玻片上滴加适量的抗荧光淬灭封片剂,然后盖上盖玻片,尽量避免产生气泡。封片剂可以减少荧光的淬灭,使观察效果更好。
尼康 TS2 显微镜显微镜设置
光源选择:尼康 TS2 显微镜通常配备有汞灯或 LED 光源。对于荧光观察,根据所使用的荧光染料的激发波长,选择合适的激发光滤光片组,并打开相应的光源。例如,观察 DAPI 标记的细胞核,需要使用紫外光激发;观察常见的绿色荧光蛋白(GFP)标记的细胞器,一般使用蓝光激发。
物镜选择:根据观察的需求和细胞的大小,选择合适的物镜。低倍物镜(如 10×、20×)可以用于观察细胞的整体形态和分布,高倍物镜(如 40×、63×、100×)则可以更清晰地观察细胞器的细节。对于观察细胞器分布,通常需要使用高倍物镜,以获得足够的分辨率。
光路调整:
开启光源后,通过调节聚光镜的高度和孔径光阑的大小,使光线均匀地照射在样品上。对于高倍物镜,可能需要适当减小孔径光阑,以提高图像的对比度。
使用荧光观察时,需要通过调节荧光光路中的反射镜和透镜,使激发光准确地照射在样品上,并使发射的荧光能够有效地被收集和成像。
尼康 TS2 显微镜观察与分析
找到细胞:将制备好的样品放在显微镜载物台上,使用低倍物镜找到细胞群体。通过调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋,使细胞图像清晰聚焦。可以移动载物台,选择细胞分布均匀、形态良好的区域进行观察。
切换到高倍物镜:在低倍物镜下确定好观察区域后,小心地切换到高倍物镜。由于高倍物镜的工作距离较短,切换时要注意避免物镜碰到样品。切换后,再次微调细准焦螺旋,使细胞器的图像达到最佳清晰度。
观察细胞器分布:根据不同荧光标记的颜色和位置,观察各种细胞器在细胞内的分布情况。例如,线粒体通常呈现为红色或绿色的点状或线状结构,分布在细胞质中;内质网可能呈现为网络状结构,分布在细胞核周围和细胞质中;高尔基体则通常表现为靠近细胞核的一些囊泡状或扁平囊状结构。
图像采集与分析:使用显微镜自带的成像系统,如 CCD 或 CMOS 相机,采集细胞和细胞器的图像。可以对采集到的图像进行分析,例如使用图像分析软件测量细胞器的大小、数量、分布密度等参数,还可以通过对不同荧光通道的图像进行叠加和分析,研究不同细胞器之间的相互关系和空间分布规律。